Nukleins\u00e4uren werden aus Probenmaterial wie Zellen isoliert und anschlie\u00dfend in weiteren Laborexperimenten eingesetzt. Dazu empfiehlt es sich, die Konzentration der aufgereinigten DNA oder RNA zu bestimmen sowie deren Reinheit zu verifizieren. Auf diese Weise gelangen genau definierte Mengen der Nukleins\u00e4ure in die nachgelagerte Anwendung, und alle Verunreinigungen, die eine empfindliche Reaktion oder einen Assay beeintr\u00e4chtigen k\u00f6nnten, werden in Echtzeit erkannt.<\/p>\n\n
Die UV-Vis-Spektrophotometrie ist eine einfache, schnelle und bew\u00e4hrte Methode, um diese Ziele zu erreichen. Im Bereich von 260 nm zeigen Nukleins\u00e4uren einen charakteristischen Extinktionspeak (Abbildung 1). Dieser Extinktionswert wird daher zur Berechnung der Nukleins\u00e4urekonzentrationen verwendet. Nach dem Lambert-Beer-Gesetz werden zur Berechnung der Konzentration einer Probe zwei Parameter ben\u00f6tigt: die optische Wegl\u00e4nge (= Lichtwegl\u00e4nge (L)) und der molare Extinktionskoeffizient (material- und wellenl\u00e4ngenspezifische Konstante) der zu messende Probe. Der spezifische Faktor (F) kann bei Verwendung einer Standardk\u00fcvette mit einem Lichtweg von 1 cm berechnet werden. Dieser Faktor wird dann mit dem gemessenen Extinktionswert (A) multipliziert, um die Konzentration (C) der Probenl\u00f6sung zu erhalten. Molare Extinktionskoeffizienten bzw. spezifische Faktoren sind typischerweise in der Literatur verf\u00fcgbar. Der Faktor f\u00fcr dsDNA betr\u00e4gt beispielsweise 50 \u00b5g\/mL (RNA: 40 \u00b5g\/mL) und entspricht per Definition einer Extinktionseinheit. diese Daten.<\/p>\n\n Um eine Aussage \u00fcber die Reinheit einer Nukleins\u00e4ureprobe machen zu k\u00f6nnen, muss die Extinktion bei anderen Wellenl\u00e4ngen als 260 nm bestimmt werden (Abbildung 1). Die Quotienten aus den bei 260 nm, 280 nm und 230 nm gemessenen Extinktionswerten (A 260<\/sub> \/A 280<\/sub> und A 260<\/sub> \/A 230<\/sub> ) stellen die Reinheitsverh\u00e4ltnisse dar, die helfen, m\u00f6gliche Verunreinigungen zu erkennen. Verunreinigungen wie Proteine und Spuren von Reagenzien, die w\u00e4hrend des Aufreinigungsprozesses verwendet wurden, ergeben ein anderes Absorptionsspektrum als Nukleins\u00e4uren und beeinflussen somit die Reinheitsverh\u00e4ltnisse (Abbildung 2). Das A 260<\/sub> \/A 280<\/sub> -Verh\u00e4ltnis von reinen Nukleins\u00e4urel\u00f6sungen betr\u00e4gt ungef\u00e4hr 1,8\u20132,0, w\u00e4hrend das Verh\u00e4ltnis A 260<\/sub> \/A 230<\/sub> typischerweise Werte im Bereich von 2,0\u20132,5 aufweist.<\/p>\n\n Eine vierte Wellenl\u00e4nge wird verwendet, um den Hintergrund zu bestimmen. Sie wird bei oder \u00fcber 320 nm gemessen, da weder Nukleins\u00e4uren noch organische Verunreinigungen Licht bei dieser Wellenl\u00e4nge absorbieren. Die in diesem Bereich gemessene Extinktion kann auf das Vorhandensein von Partikeln oder Luftblasen in der Probe hinweisen. Selbst eine verschmutzte K\u00fcvette kann einen Hintergrundwert hervorrufen. Moderne Photometer bieten die M\u00f6glichkeit, eine Hintergrundkorrektur zu aktivieren, die eine automatische Subtraktion der Hintergrundabsorption von allen anderen Messwerten bewirkt.<\/p>\n\n Au\u00dferdem kann das vollst\u00e4ndige Spektrum einer Nukleins\u00e4ureprobe erfasst werden (typischerweise zwischen 220 und 320 nm). Vergleiche mit dem Spektrum einer reinen Nukleins\u00e4urel\u00f6sung erm\u00f6glichen die Erkennung m\u00f6glicher Fehler w\u00e4hrend des Messvorgangs sowie des Vorhandenseins von Verunreinigungen in der Probe.<\/p>\n\nLambert-Beer-Gesetz:<\/strong> C = Konzentration ![\"\"](\"https:\/\/cotslab.com\/wp-content\/uploads\/2021\/10\/csm_Figure_One_Rahmen_b55fd8fbd6.jpg\")
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