This post is also available in:
Nederlands (Холандски) 
English (Английски) 
Français (Френски) 
polski (Полски) 
Español (Испански) 
Čeština (Чешки) 
Esperanta (Есперанто) 
Eesti (Естонски) 
Deutsch (Немски) 
Gaeilge (Ирландски) 
Italiano (Италиански) 
한국어 (Корейски) 
Melayu (Малайски) 
Norsk bokmål (Норвежки книжовен) 
Português (Португалски (Португалия)) 
Svenska (Шведски)
Измерването на абсорбцията на разтвор на нуклеинова киселина само при четири дължини на вълната е достатъчно, за да се определи неговата концентрация и да се получи представа за неговата чистота.
Източник на изображението: DRogatnev/shutterstock.com
Нуклеиновите киселини се изолират от пробен материал като клетки и впоследствие се използват в по-нататъшни лабораторни експерименти. За тази цел е препоръчително да се определи концентрацията на пречистената ДНК или РНК, както и да се провери тяхната чистота. По този начин точно определени количества от нуклеиновата киселина ще влязат в приложението надолу по веригата и всички замърсявания, които могат да повлияят на чувствителна реакция или анализ, се откриват в реално време.
UV-Vis спектрофотометрията е лесен, бърз и изпитан във времето метод за постигане на тези цели. В диапазона от 260 nm нуклеиновите киселини показват характерен пик на абсорбция (фигура 1). Следователно тази стойност на абсорбция се използва за изчисляване на концентрациите на нуклеинова киселина. Съгласно закона на Lambert-Beer, два параметъра са необходими за изчисляване на концентрацията на пробата: дължината на оптичния път (= дължината на светлинния път (L)) и коефициента на моларна екстинкция (константа, специфична за материала и дължината на вълната) на проба за измерване. Специфичният фактор (F) може да се изчисли, когато се използва стандартна кювета със светлинен път от 1 cm. След това този коефициент се умножава по измерената стойност на абсорбция (A), за да се стигне до концентрацията (C) на разтвора на пробата. Коефициентите на моларна екстинкция и съответно специфични фактори обикновено са налични в литературата. Факторът за dsDNA, например, е 50 µg/mL (РНК: 40 µg/mL) и по дефиниция е еквивалентен на една единица абсорбция. тези данни.
| Законът на Ламбърт-Бира: C = A/(L x Ɛ) F = 1/Ɛ (за светлинен път от 1 см) – C = A x F | C = Концентрация A = Абсорбция L = Оптична (светлинна) дължина на пътя Ɛ = Моларен коефициент на екстинкция (специфична за пробата и дължината на вълната) F = фактор |
За да може да се направи изявление относно чистотата на пробата от нуклеинова киселина, трябва да се определи абсорбцията при дължини на вълната, различни от 260 nm (фигура 1). Коефициентите, получени от стойностите на абсорбция, измерени при 260 nm, 280 nm и 230 nm (A 260 /A 280 и A 260 /A 230 ), представляват съотношенията на чистота, които помагат да се идентифицират възможните замърсявания. Примеси като протеини и следи от реагенти, използвани по време на процеса на пречистване, дават различен спектър на абсорбция от този на нуклеиновите киселини и по този начин влияят върху съотношенията на чистота (фигура 2). Съотношението A 260 /A 280 на чистите разтвори на нуклеинова киселина ще бъде приблизително 1,8 – 2,0, докато съотношението A 260 /A 230 обикновено показва стойности в диапазона от 2,0 – 2,5.
За определяне на фона се използва четвърта дължина на вълната. Измерва се при или над 320 nm, тъй като нито нуклеиновите киселини, нито органичните замърсители абсорбират светлина при тази дължина на вълната. Абсорбцията, измерена в този диапазон, може да показва наличието на частици или въздушни мехурчета в пробата. Дори размазана кювета е в състояние да предизвика фоново отчитане. Съвременните фотометри предлагат опцията за активиране на функция за корекция на фона, която ще доведе до автоматично изваждане на всяка фонова абсорбция от всички други измерени стойности.
В допълнение, пълният спектър на проба от нуклеинова киселина може да бъде уловен (обикновено между 220 и 320 nm). Сравненията със спектъра, получен от чист разтвор на нуклеинова киселина, ще позволи откриването на възможни грешки по време на процеса на измерване, както и наличието на замърсители в пробата.
